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流式细胞检测的一般步骤

发布时间:2013-06-08 14:22 点击次数:

 

1.实验材料:检测管或96微孔板 一抗(FITC标记),以表记Anti-CD19/FITC抗体为例
缓冲液:PBS(PH7.4)
设备:移液器、离心机、冰盒或冰箱、流式细胞仪
2. 注意事项:标记抗体在使用之前用PBS溶解并振匀,并确认没有沉淀,迅速离心几秒,使所有的液体都集中到管底,标记抗体应避光4℃保存,避免冻结,因样本的固定保存或较长时间放置可能会影响细胞表面分子和抗体之间的结合,故建议尽可能使用新鲜样品。
3. 操作方法:
一. 以大鼠淋巴组织细胞表面抗原的流式检测步骤为例
样品制备:
取出大鼠淋巴组织块,迅速浸泡在10ml的缓冲液中,并用注射器的活塞研磨或使用两块预冷的载玻片研压成单细胞。
把悬液转移到50ml的锥形管中静置片刻,使细胞团块和碎片沉降到管底,并通过尼龙网过滤成单细胞悬液。
在4℃下300-400g离心4-5分钟,除去上清液。
如果该样品为脾脏细胞,加入一定量的RBC lysis裂解红细胞,或者用分离液分离出淋巴细胞。若为其它样品,不用此步骤。
加入50ml 缓冲液重悬细胞后计数,根据需要用台盼蓝(Trypan Blue)进行细胞活性检测。
离心细胞液并除去上清;用适量的缓冲液重悬细胞为2×107个/ml。采用直接标记的一抗,则加入CD19/FITC抗体(0.5-1ug/106细胞)冰上孵育5-10分钟。
细胞荧光染色步骤:
1. 在每个流式检测管或板式微孔中加入50ul的稀释后的一抗;在空白管/孔或同型对照管/孔中加入50ul 缓冲液。若进行抗体最佳浓度测试,建议范围2-0.03ug/106细胞。
2. 在各管/孔中分别加入50ul细胞悬液(约106细胞),并轻轻混匀。
3. 避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20分钟。 (注意:有些抗体可能需要更长的孵育时间,建议实验者进行预试验摸索)
4. 孵育完成后,加入缓冲液(每流式检测管中加2ml,而每微孔中加200ul) 4℃下300-400g离心5分钟,并弃去上清。
5. 重复洗涤过程3次。
6. 重悬细胞后上流式仪检测。
7. 使用直接标记一抗,用500ul 缓冲液重悬细胞后上机检测。 若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体,则每管/孔加入50-100ul稀释好的荧光标记二抗或荧光标记亲和素(用缓冲液稀释成合适的浓度)后于冰浴或在4℃冰箱中避光孵育15-30分钟。洗涤细胞两次(参考第4步和第5步方法)。之后500ul缓冲液重悬细胞,并上机检测。
8. 试验结果分析:(注:若要对多个细胞表面抗原进行多色标记,则同时加入荧光标记抗体后按以上操作步骤进行孵育和细胞洗涤;操作尽量保持在避光和4℃左右的温度下进行)

二.以人外周血细胞表面抗原的流式检测步骤为例
1. 在每个流式检测管或板式微孔中加入50ul的荧光标记或生物素标稀释后的一抗(抗体用缓冲液稀释成合适的浓度);在空白管/孔或同型对照管/孔中加入50ul 缓冲液。
2. 每管分别加入100ul全血,并轻轻混匀。
3. 避光孵育15-30分钟。 (注:有些结合能力较低的抗体可能需要更长的孵育时间,建议实验者进行预试验摸索)
4. 每管分别加入2ml RBC lysis Buffer(之前预热恢复至室温),混合均匀。
5. 室温避光孵育10分钟,此孵育时间不要超过15分钟。
6. 室温300-400g离心5分钟,并弃去上清。
7. 用2ml 缓冲液洗涤细胞一次。
8. 重悬细胞后上流式仪检测。
9. 若使用的一抗是荧光直接标记抗体,用500ul 缓冲液或2%的多聚甲醛固定液重悬细胞后上机检测。 若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体,则每管/孔加入50-100ul稀释好的荧光标记二抗或荧光标记亲和素(用缓冲液稀释成合适的浓度)后于室温避光孵育15-30分钟。洗涤细胞1-2次(参考第7步方法)。之后500ul或2%的多聚甲醛固定液重悬细胞,并上机检测。
10. 试验结果分析。 (注:若要对多个细胞表面抗原进行多色标记,则同时加入荧光标记抗体后按以上操作步骤进行孵育和细胞洗涤;操作尽量保持在避光条件下进行)